Прямая проба кумбса. Проба кумбса при диагностике гемолитической болезни новорожденных Ветлаборатории делающие анализ на реакцию кумбса

Прямая проба Кумбса . С помощью этой пробы доказывают наличие фиксированных эритроцитами ребенка блокирующих антител. Положительная прямая проба свидетельствует о сенсибилизации и служит убедительным признаком гемолитической болезни новорожденного еще до появления других клинических признаков. Как исключение и только в очень тяжелых случаях прямая проба Кумбса может оказаться отрицательной в связи с уже наступившим, почти полным гемолизом сенсибилизированных эритроцитов.

Прямая проба Кумбса выполняется следующим образом: 5 капель крови, взятой из пятки ребенка, помещают в пробирку и добавляют 5 мл физиологического раствора. Хорошо размешивают и центрифигуриуют в течение 10 мин. Отделяют прозрачную жидкость над осадком эритроцитов. Затем снова добавляют 5 мл физиологического раствора, смешивают и центрифигурируют. После трехкратного смешивания с физиологическим раствором эритроциты хорошо промыты. После последнего отделения надосадочной жидкости эритроцитный осадок в количестве 0,1 мл смешивают с 0,9 мл физиологического раствора. Наносят 2-3 капли этой смеси на предметное стекло и добавляют одну каплю сыворотки Кумбса. Наличие агглютинации указывает на то, что реакция положительна, (положительная прямая проба Кумбса). Исследование следует проводить при комнатной температуре выше 16°, чтобы избежать действия Холодовых агглютининов.

Непрямая проба Кумбса служит доказательством наличия свободных антител в сыворотке матери и выполняется с сывороткой крови матери.

Гемолитическая болезнь у новорожденного при Rh-несовместимости проявляется обыкновенно после второй беременности. Первый ребенок рождается здоровым, второй с признаками слабо выраженной анемии и только после третьей беременности рождаются дети с явными признаками гемолитической болезни. Только у предварительно сенсибилизированных женщин еще при первой беременности может родиться ребенок с симптомами гемолитической болезни. В некоторых случаях иммунизация вызывает аборты и рождение мертвых детей. Для начала и тяжести заболевания имеют значение состояние плаценты и продолжительность воздействия материнских агглютининов на плод. При появлении агглютининов за 10-14 недель до родов у ребенка обычно наблюдаются субклинические формы. Раннее появление агглютининов, за 15-26 недель до родов, вызывает тяжелые формы заболевания. При всех формах заболевания основным процессом является гемолиз. Последствие реакции антиген - антитело - гемолиз, поражение печеночных и мозговых капилляров. В зависимости от того, какое поражение преобладает, наблюдаются и различные формы заболевания. Опасны и некоторые анафилактические явления. Они приводят к образованию гистаминоподобных субстанций, вызывающих тяжелейшие поражения печеночной клетки и особенно ганглионарных клеток базальных ядер, аммонового рога, продолговатого мозга и даже коры головного мозга. При поражении печеночных клеток к экстрагепатальной желтухе добавляется и гепатальная. Дети погибают при тяжелых явлениях ядерной желтухи. Если они выживают, остаются симптомы поражений нервной системы (нарушения со стороны экстрапирамидальной системы с хореоатетозными движениями, своеобразной танцующей походкой, принудительными движениями головы, иногда расстройство координации произвольных движений с частым падением, повышенным тонусом мышц, умственной отсталостью, т. е. с признаками так наз. encephalopathia posticteria infantum).

На тарелку или предметное стекло наносятся пипетками (разными!) по 1-й крупной капле сыворотки О(I), А(II), В(III). Заметив время, чистой стеклянной палочкой или чистым углом предметного стекла капли сывороток соединяются с каплями крови. Определение длится 5 минут, покачивая тарелку, затем к каждой смеси капель добавляют по 1-й капле физраствора и оценивают результаты. Лучше, если сыворотка будет 2-х различных серий. Результаты групп крови должны совпадать в обеих сериях сыворотки.

Оценка результатов изогемагглютинации:

изогемагглютинация. При положительной реакции в смеси появляются мельчайшие красные зернышки склеивающихся эритроцитов. Зернышки сливаются в более крупные зерна, а последние в хлопья. Сыворотка почти обесцвечивается;

при отрицательной реакции смесь в течение 5 мин остается равномерно окрашенной в розовый цвет и никаких зернышек не обнаруживается;

при работе с 3-я сыворотками групп О(I), А(II), В(III) возможны 4 комбинации реакций:

1. если все 3 сыворотки дали отрицательную реакцию, то есть смесь равномерно окрашена в розовый цвет - это О(I) группа крови;

   если отрицательную реакцию дала только сыворотка группы А(II), а сыворотки О(I) и В(III) дали положительную реакцию, то есть появились зерна - это А(II) группа крови;

   сыворотка группы В(II) дала отрицательную реакцию, а сыворотки группы О(I) и А(II) дали положительную - это В(III) группа крови.

все 3 сыворотки дали положительные реакции - испытуемая кровь АВ(IV) группы. В этом случае проводится исследование с сывороткой АВ(IV) группы.

Обратите внимание! Капли исследуемой крови должны быть в 5-10 раз меньше капель сыворотки.

Ошибки изогемагглютинации.

Невыполнение агглютинации, где она должна быть и наличие агглютинации, где ее быть не должно. Это может быть при слабом титре сыворотки плюс плохая агглютинация эритроцитов.

Наличие агглютинации, где ее быть не должно - это псевдоагглютинация, когда кучки эритроцитов образуют "монетные столбики". Покачивание тарелки или добавление физраствора их разрушают.

Панагглютинация, когда сыворотка склеивает все эритроциты, в то числе и своей группы крови. К 5-й минуте признаки агглютинации исчезают.

Имеется еще так называемая холодовая панагглютинация, когда склеивание эритроцитов происходит из-за низкой температуры воздуха (ниже 15 °С) в помещении.

Во всех этих случаях проводят либо повторную реакцию, либо по стандартным эритроцитам.

Определение резус-принадлежности крови

Для определения резус-принадлежности, т. е. выявления в крови людей наличия или отсутствия антигенов системы резус используют стандартные сыворотки (реагенты) анти-резус, различные по специфичности, т. е. содержащие антитела по отношению к различным антигенам этой системы. Для определения антигена Rh 0 (D) чаще всего применяют сыворотку антирезус с добавлением 10% раствора желатина или используют стандартный реагент анти-резус, приготовленный заранее с 33% раствором полиглюкина. Для получения более точных результатов исследования, а также для выявления антигенов других серологических систем используют пробу Кумбса (она очень чувствительна также при определении совместимости переливаемой крови). Для исследования используют кровь нативную или приготовленную с каким-либо консервантом. В этом случае кровь следует отмывать от консерванта десятикратным объемом изотонического раствора хлорида натрия.При определении резус-принадлежности - Rh 0 (D) следует применять два образца сыворотки или реагента анти-резус двух различных серий и одновременно использовать для контроля стандартные эритроциты, полученные из крови от резус-положительных (Rh +) и резус-отрицательных (Rh -) лиц. При определении других изоантигенов должны соответственно применяться контрольные эритроциты, в которых содержится или отсутствует тот антиген, против которого направлены антитела в стандартной сыворотке.

Неполные тепловые агглютинины являются наиболее частой разновидностью антител, способных вызывать развитие аутоиммунных гемолитических анемий. Эти антитела относятся к IgG, редко - к IgM, IgA.

ПРОБА КУМБСА

Проба Кумбса: введение. Проба Кумбса - метод лабораторной диагностики, основанный на реакции гемагглютинации.

Основной метод диагностики аутоиммунных гемолитических анемий - проба Кумбса. В основе ее лежит способность антител, специфичных к иммуноглобулинам (особенно к IgG) или компонентам комплемента (особенно СЗ), агглютинировать эритроциты, покрытые IgG или СЗ.

Связывание IgG и СЗЬ с эритроцитами наблюдается при аутоиммунной гемолитической анемии и лекарственной иммунной гемолитической анемии. Прямая проба Кумбса. Прямая проба Кумбса применяется для выявления антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритроцитов. Она проводится следующим образом:

Для получения антител к человеческим иммуноглобулинам (антиглобулиновой сыворотки) или комплементу (антикомплементарной сыворотки) животное иммунизируют человеческой сывороткой, иммуноглобулинами или комплементом человека. Полученную от животного сыворотку очищают от антител к другим белкам.

Эритроциты больного отмывают физиологическим раствором для полного удаления сыворотки, которая нейтрализует антитела к иммуноглобулинам и комплементу и может стать причиной ложноотрицательного результата.

Если на поверхности эритроцитов фиксированы антитела или компоненты комплемента, добавление антиглобулиновой или антикомплементарной сыворотки вызывает агглютинацию эритроцитов.

Прямую пробу Кумбса применяют в следующих случаях:

Аутоиммунный гемолиз.

Гемолитическая болезнь новорожденных.

Лекарственная иммунная гемолитическая анемия.

Гемолитические трансфузионные реакции. Непрямая проба Кумбса. Непрямая проба Кумбса позволяет обнаружить антитела к эритроцитам в сыворотке. Для этого сыворотку больного инкубируют с донорскими эритроцитами группы 0, а затем проводят прямую пробу Кумбса.

Непрямую пробу Кумбса применяют в следующих случаях:

Определение индивидуальной совместимости крови донора и реципиента.

Выявление аллоантител, включая антитела, вызывающие гемолитические трансфузионные реакции.

Определение поверхностных эритроцитарных антигенов в медицинской генетике и судебной медицине.

Подтверждение однояйцовости близнецов при трансплантации костного мозга.

Для проведения биологической пробы кровь начинают переливать по возможности быстро (желательно струйно). После переливания 25 мл крови трубка системы пережимается зажимом. Затем делается пауза на 3 мин, во время которой ведется наблюдение за состоянием реципиента. Для постановки биологической пробы кровь по 25 мл вводится трижды. По окончании пробы (после переливания первых 75 мл крови дробными дозами по 25 мл с интервалами 3 мин) система регулируется на необходимую скорость переливания. При переливании больному более одного флакона крови необходимости извлекать иглу из вены. В этом случае из пробирки флакона, в котором кончилась кровь, игла извлекается и вводится в следующий флакон. Трубка системы (резиновая или пластмассовая) пережимается в этот момент зажимом. Если во время переливания крови возникает необходимость внутривенного введения реципиенту какого-либо другого препарата, это осуществляют путем прокалывания резиновой трубки системы. Проколы пластикатовой трубки недопустимы, так как они не спадаются. После каждой гемотрансфузии за больным необходимо наблюдение для выявления и своевременного устранения возможных осложнений, в том числе аллергических реакций. Через 2 часа после окончания гемотрансфузии следует измерить температуру тела. При повышении ее измерение необходимо повторять в последующие 4 часа через каждый час. Не меньшее значение имеет наблюдение за мочеотделением и составом мочи, которое дает возможность установить наличие токсической посттрансфузионной реакции. Наступление олигурии и анурии после переливания крови, наличие в моче форменных элементов крови и белка являются прямым указанием на развитие посттрансфузионного гемолиза.

Принцип антиглобулинового . Антиэритроцитные антитела неполного типа и молекулы комплемента (С), находящиеся на поверхности эритроцитов выявимы - прямой тест - их агглютинацией в контакте с животной сывороткой, содержащей антитела на человеческий антиглобулин (антиглобулиновая сыворотка). Свободные в сыворотке неполные антитела выявляются - косвенный тест - их закреплением на смеси нормальных эритроцитов группы 0, все антигены которых принадлежат известной резус-системе, далее агглютинируемые под воздействием антиглобулиновой сыворотки.

Материалы, реагенты антиглобулинового теста Кумбса : пробирки на 10/100 мл; градуированные пипетки на 1, 2 мл; пастеровские пипетки; штативы; предметные нешлифованные стекла; 8,5‰ раствор NaCl; эритроциты. Эритроциты больного, равно как и принадлежащие к группе 0 получим из свежеотобранной крови на противосвертывающем веществе (раствор ЭДТА).

Эритроциты группы 0 отобрать с таким расчетом, чтобы они исходили от лиц в норме и содержали все антигены резус-системы . Их можно сохранять до 7 дней в аутологической плазме, при температуре + 4°С. В случае отсутствия эритроцитов группы 0, известной антигенной мозаики, можно использовать смесь эритроцитов группы 0, резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.

Сыворотка больного должна быть свежеотобранной.

Антиглобулиновая сыворотка производится институтом им. д-ра И. Кантакузино, выпускается в лиофилизированном виде в содержащих 1 мл ампулах. После растворения сыворотку хранить при температуре -20°С.

Техника антиглобулинового теста Кумбса :
а) Прямой тест Кумбса : эритроциты больного промыть 3 раза 8,5‰ раствором NaCl.
На несколько предметных стекол нанести по крупной капле из разведений антиглобулиновой сыворотки, а рядом - по маленькой капле из осадка эритроцитов больного; перемешать капли углом стекла. Приготовленный материал оставить на столе 5 мин., затем исследовать на наличие агглютинатов. В случае положительного результата определить максимальный агглютинирующий титр.

б) Косвенный тест Кумбса : эритроциты группы 0, резусположительные и резус-отрицательные промыть 3 раза 8,5‰ раствором NaCl и подвергнуть воздействию сыворотки больного из расчета 2 капли эритроцитов на 8-10 капель сыворотки, затем, в течение 60 мин., провести инкубацию при температуре 37°С. После этого снова трижды промыть эритроциты и воздействовать на них антиглобулиновой сывороткой, по указаниям для прямого теста Кумбса.

Когда речь идет о холодовых активных антителах сенсибилизацию эритроцитов группы 0 провести 60 мин. при температуре + 4°С.

Примечание : 1) Не проводить прямой тест Кумбса на эритроцитах, сохраненных один или несколько дней при температуре + 4°С или комнатной температуре, поскольку результаты могут оказаться ложноположительными за счет фиксации имеющихся в нормальной сыворотке непол ных, активных на холоде антител. 2) В случаях выраженной гиперпротеинемии промывать эритроциты 4-5 раз и проверить отсутствие сывороточных белков в последней промывной жидкости, с помощью сулфосалициловой кислоты.

Возможный остаток 2 мкг IgG/мл в эритроцитном осадке может нейтрализовать антиглобулиновую сыворотку . Тест Кумбса можно проводить и с помощью моноспецифических анти-IgG, -IgM, -IgA -С3 и -С4 сывороток в целях уточнения вида, находящихся на поверхности эритроцитов глуболин, например, у страдающих аутоиммунной гемолитической анемией.

Антитела , находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть как в статичном, так и в свободном состоянии вплазме крови . В зависимости от состояния антител проводится прямая или непрямая реакция Кумбса. Если есть основания для предположения, что антитела зафиксированы на поверхности эритроцитов, проводится прямой тест Кумбса. В этом случае тест проходит в один этап - добавляетсяантиглобулиновая сыворотка . Если на поверхности эритроцитов присутствуют неполные антитела, происходитагглютинация эритроцитов.

Непрямая реакция

Непрямая реакция Кумбса протекает в 2 этапа. Сначала необходимо искусственно осуществить сенсибилизацию эритроцитов. Для этого эритроциты и исследуемую сыворотку крови инкубируют, что вызывает фиксацию антител на поверхности эритроцитов. После чего проводится второй этап теста Кумбса - добавление антиглобулиновой сыворотки.

Реакция преципитации - РП (от лат praecipilo осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом . Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.

HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека - HLA комплекса. Это образование включает в себя область генов на 6-й хромосоме, которые кодируют HLA-антигены, участвующие в различных реакциях иммунного ответа.

Задачи при HLA типировании могут стоять самые разные - биологическая идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами), определение предрасположенности к различным заболеваниям, подбор доноров для пересадки органов - при этом производится сравнение результатов HLA типирования тканей донора и реципиента. С помощью HLA типирования определяют, и насколько супруги сходны или различимы по антигенам тканевой совместимости, чтобы диагностировать случаи бесплодия.

HLA типирование предполагает анализ полиморфизма HLA и проводится двумя методами - серологическим и молекулярно-генетическим. Классический серологический метод HLA типирования основан на микролимфоцитотоксическом тесте, а молекулярный метод использует проведение ПЦР (полимеразную цепную реакцию).

Серологическое HLA типирование проводится на выделенных клеточных популяциях. Антигены главного комплекса гистосовместимости несут на себе в основном лимфоциты. Поэтому суспензию Т лимфоцитов используют в качестве основных носителей антигенов I класса, и суспензию В лимфоцитов для определения антигенов HLA II класса. Для выделения необходимых клеточных популяций из цельной крови используют либо центрифугирование, либо иммуномагнитную сепарацию. Считается, что первый способ может привести к ложноположительным данным, так как при этом происходит гибель части клеток. Второй способ признан более специфичным - при этом более 95% клеток остаются жизнеспособными.

Но основой постановки лимфоцитотоксического теста HLA типирования является специфическая сыворотка, содержащая антитела к различным аллельным вариантам антигенов HLA I и II классов. Серологический тест позволяет определить HLA-тип путем изучения того, какие из сывороток реагируют с лимфоцитами, а какие - нет.

Если между клетками и сывороткой происходит реакция, в результате на поверхности клетки образуется комплекс антиген-антитело. После добавления раствора, содержащего комплемент, происходит лизис и гибель клетки. Оценивают серологический тест HLA типирования с помощью флуоресцентной микроскопии по оценке позитивной (красная флуоресценция) и негативной (зеленая флуоресценция) реакций, или фазово-контрастной микроскопии по окраске ядер погибших клеток. Результат HLA типирования выводят с учетом специфичности прореагировавших сывороток и перекрестно реагирующих групп антигенов, интенсивности реакции цитотоксичности.

Недостатками серологического HLA типирования являются наличие перекрестных реакций, слабое сродство антител или низкая экспрессия HLA-антигенов, отсутствие белковых продуктов у ряда HLA-генов.

Более современные, молекулярные методы HLA типирования используют уже стандартизованные синтетические образцы, которые реагируют не с антигенами на поверхности лейкоцитов, а с ДНК и прямо указывают на то, какие антигены присутствуют в пробе. Молекулярные методы не требуют живых лейкоцитов, любая человеческая клетка может быть подвержена изучению, и для работы достаточно несколько микролитров крови или можно ограничиться соскобом со слизистой оболочки рта.

Молекулярно-генетическое HLA типирование использует метод ПЦР, первым этапом которой является получение чистой геномной ДНК (из цельной крови, лейкоцитарной суспензии, тканей).

Затем образец ДНК копируется - амплифицируется в пробирке с использованием праймеров (коротких одноцепочечных ДНК), специфичных к определенному HLA -локусу. Концы каждого из пары праймеров должны быть строго комплементарны уникальной последовательности, соответствующей конкретному аллелю, в противном случае амплификация не осуществляется.

После ПЦР, в ходе многократного копирования, получается большое количество фрагментов ДНК, которое можно оценить визуально. Для этого реакционные смеси подвергают электролизу или гибридизации, и определяют, произошла ли специфическая амплификация, при помощи программы или таблицы. Результат HLA типирования представляется в форме всестороннего отчета на генном и аллельном уровнях. Из-за стандартизованности используемых образцов, молекулярное HLA типирование точнее серологического. Кроме того, оно дает больше информации (больше новых аллелей ДНК) и более высокий уровень ее детализации, поскольку позволяет идентифицировать не только антигены, но и сами аллели, обуславливающие, какой именно антиген присутствует на клетке.

Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации Холерных и холероподобных вибрионов).

Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток. Количество клеток, секретирую-щих антитела - гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент.

Иммунофлюоресцентный метод

(РИФ, реакция иммунофлюоресценции) - метод выявления специфических Аг (Ат) с помощью Ат (Аг), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-д-ки инфекц. заболеваний (идентификация возбудителя в иссл. материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Прямой И. м. состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной к-ры с-кой, содержащей специфические Ат, конъюгированные с флюорохромом; препарат промывают для освобождения от несвязанных Ат и рассматривают в люминесцентный микроскоп. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Необходим контроль для исключения неспецифического свечения. Принепрямом. И. м. на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующей специфической с-кой, на втором -люминесцирующей с-кой против-глобулинов того животного, с-ка к-рого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из Аг, Ат к нему и Ат против Ат (сэндвич-метод). Кроме люминесцентного микроскопа для учета РИФ при фенотипировании клеток применяютлазерный сортировщик клеток .

Проточная цитометрия - метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).

рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).

интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Из множества существующих антигенов в медицинской практике наибольшее значение уделяется трем типам агглютиногенов крови. Одним из них является тип ответственный за проявление резус-фактора: если он присутствует на мембране эритроцита, диагностируют Rh+ группу крови, если отсутствует - Rh-. Если в состав резус-отрицательной крови попадают эритроциты с агглютиногенами Rh+, организм запускает реакцию иммунного ответа и начинает вырабатывать антитела к этому антигену, что становится причиной патологических состояний.

СПРАВКА! Резус-фактор — сложная многокомпонентная система из нескольких десятков антигенов. Наиболее часто встречаемые из них — агглютиногены типа D (85% случаев), а также E и C.

Пробу Кумбса проводят только при наличии прямых показаний. Общий список причин для назначения пробы Кумбса:

• планирование и ведение беременности (родители имеют разный Rh);
• донорство и подготовка к переливанию крови (несовпадение крови по Rh не менее губительно, чем несовпадение по системе АВ0);
• планируемое хирургическое вмешательство (на случай восполнения кровопотери с помощью переливания крови);
• диагностика гемолитических болезней.

Более конкретные показания зависит от типа проводимого исследования.

Прямая проба Кумбса

Прямой тест позволяет обнаружить антитела на поверхности эритроцитов. Это необходимо для диагностики уже имеющихся гемолитических патологий :

• аутоиммунных (эритроциты и гемоглобин разрушаются в результате атаки антител собственного организма);
• медикаментозных (патологический процесс запускает прием некоторых лекарственных препаратов типа хинидина или прокаинамида);
• посттрансфузионных (при несовпадении группы крови при переливании), а также в виде резус-конфликта при беременности (эритробластоз новорожденных).

СПРАВКА! Гемолитическая анемия - заболевание, связанное с преждевременным разрушением эритроцитов в результате гемолиза, что приводит к недостаточному насыщению крови кислородом и гипоксии головного мозга и/или внутренних органов.

Гемолиз кровяных элементов наблюдается при онкологических, инфекционных, ревматических заболеваниях, поэтому прямая проба Кумбса может использоваться как дополнительное средство диагностики патологического состояния. При этом стоит помнить: отрицательное значение анализа не исключает вероятность гемолиза, а является поводом для дополнительного обследования.

Непрямая проба Кумбса

Непрямая проба чаще применяется для предотвращения патологических ситуаций. Она помогает выявить антитела в плазме крови, что необходимо для оценки совместимости при переливании и диагностики рисков резус-конфликта во время беременности.

Более 80% людей имеют положительный резус-фактор (Rh+), соответственно, чуть менее 20% являются резус-отрицательными. Если у Rh- матери развивается Rh+ ребенок, ее организм начинает вырабатывать антитела, атакующие эритроциты плода, провоцируя гемолиз.

С учетом того, что процент “разнорезусных” браков достигает 12-15%, риск гемолитической болезни новорожденных должен быть велик, но в реальности лишь в 1 из 25 подобных случаев у женщин наблюдается явление сенсибилизации (на 200 успешных родов 1 пример гемолитической патологии). Частично это обусловлено тем, что первый резус-положительный ребенок обычно не вызывает открытой агрессии организма матери; подавляющее количество случаев приходится на второго и последующих детей. Действует тот же принцип, что и при обычной сенсибилизации к тому или иному аллергену.

При первом контакте реакции не происходит. Организм только знакомится с новым для него антигеном, вырабатывая антитела класса IgМ, которые отвечают за быстрый иммунный ответ, но редко проникают через плацентарный барьер в кровь ребенка. Все патологические реакции проявляются при повторной “встрече”, когда в организме начинают вырабатываться антитела класса IgG, легко проникающие в кровоток плода, запуская процесс гемолиза.

Непрямая проба Кумбса при беременности позволяет обнаружить наличие антител в организме матери и вовремя выявить начальную стадию сенсибилизации. Положительный ответ, требует постановки на учет с ежемесячным исследованием титра антител и обязательной госпитализацией за 3-4 недели до родов.

СПРАВКА! Несовместимость по резус-фактору на состоянии матери никак не сказывается, гемолитическая болезнь развивается только у ребенка. В тяжелых случаях и при отсутствии своевременной реакции плод может погибнуть еще в утробе или сразу после рождения.

Подготовка к процедуре и ее проведение

Для диагностики используют венозную кровь. Специальная длительная подготовка к проведению пробы Кумбса не требуется. Старайтесь соблюдать стандартный набор правил перед взятием крови из вены на анализ:

• за 3 суток откажитесь от алкоголя, медикаментозных препаратов (по возможности);
• последний прием пищи планируйте на позже, чем за 8 часов до взятия крови на анализ;
• за 1 час откажитесь от курения, физических, умственных и эмоциональных нагрузок;
• перед процедурой выпейте стакан чистой негазированной воды.

Метод исследования основан на реакции гемагглютинации.

При проведении прямой пробы на образец крови воздействуют заранее заготовленной антиглобулиновой сывороткой с известными показателями, выдерживают смесь некоторое время и проверяют на предмет агглютинатов, которые образуются при наличии на эритроцитах антител. Уровень содержания агглютинатов диагностируют с помощью агглютинирующего титра.

Непрямая проба Кумбса имеет сходную методику, но более сложную последовательность действий. В отделенную сыворотку крови вводят антигенные эритроциты (с резус-фактором) и только после этих манипуляций добавляют антиглобулиновую сыворотку для диагностики и титра агглютинатов.

Результаты исследования

В норме и прямая, и непрямая проба Кумбса должны давать отрицательный результат:

• отрицательная прямая проба свидетельствует о том, что специфические антитела к резус-фактору, связанные с эритроцитами, в крови отсутствуют и не могут являться причиной гемолиза
• отрицательная непрямая проба показывает, что свободные антитела к резус-фактору в плазме крови также отсутствуют; факт свидетельствует о совместимости крови донора с кровью реципиента (или крови матери и ребенка) по резус-фактору.

Положительная проба Кумбса говорит о факте резус-сенсибилизации организма, что является главной причиной резус-конфликта в случае переливания крови или при вынашивании ребенка с иным резус-статусом. В этом случае результаты сохраняются неизменными в течение 3-х месяцев (срок жизни эритроцитов). Если причиной стала аутоиммунная гемолитическая анемия, то положительная проба может преследовать пациента на протяжении нескольких лет (в ряде случаев - всю жизнь).

СПРАВКА! Антиглобулиновый тест отличается высокой чувствительностью, но имеет малую информативность. Он не регистрирует активность гемолитического процесса, не определяет тип антитела и не в состоянии выявить причину патологии. Для получения более полной картины, лечащий врач обязательно назначает дополнительные исследования (микроскопию крови, общий и биохимический анализ, ревмопробы, СОЭ, уровень железа и ферритина).

Степень сенсибилизации может иметь качественное выражение (от «+» до «++++») или количественное - в виде титра:

• 1:2 - низкое значение, не представляет опасности;
• 1:4 - 1:8 - начало развития иммунологической реакции; не представляет опасности, но требует постоянного контроля;
• 1:16 -1:1024 - яркая форма сенсибилизации, следует незамедлительно принять меры.

Причиной положительной пробы могут стать:

• переливание нетипированной крови (или с ошибкой типирования), когда резус-фактор донора и реципиента не совпадают;
• резус-конфликт при беременности (если состав антигенов крови у отца и матери не совпадают);
• аутоиммунная гемолитическая анемия - как врожденная (первичная), так и вторичная, которая является следствием некоторых болезней (синдрома Эванса, инфекционной пневмонии, сифилиса, холодовой гемоглобинурии, лимфомы);
• медикаментозная гемолитическая реакция.

Ни одна из вышеперечисленных проблем не может быть решена пациентом без врачебной помощи. Во всех случаях потребуется срочная консультация, постановка на учет или экстренная госпитализация.

ВНИМАНИЕ! В редких случаях возможна ложноположительная проба Кумбса. Причиной этого могут стать частые переливания крови, а также ряд заболеваний: ревматоидные артриты, красная волчанка, саркоидозы. Также это явление может наблюдаться после удаления селезенки, а также при нарушении хода реакции (частые встряхивания содержимого, наличие загрязняющих примесей).